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Cell Reports 姜畅博士等利用CRISPRCas9揭示CD40NF-kB通路的多层

发布时间:2019-11-05 05:37 来源:未知 编辑:admin

  CD40是肿瘤坏死因子受体家族的重要成员,广泛表达在B细胞,活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞,以及树突状细胞,巨噬细胞等免疫细胞表面。CD40的配体分子CD40L, 即CD154是肿瘤坏死因子家族成员,主要表达在活化的CD4+T细胞表面,提供T细胞和B细胞活化所必需的系统刺激信号。CD40和CD40L在细胞免疫和胸腺依赖性体液免疫中具有重要的调节作用。CD4+T细胞表面的CD40L与B细胞表面的CD40分子结合为B细胞活化提供第二信号,在B细胞应答、发生中心生成、抗体类别转换、成熟以及记忆B细胞生成等过程中起到重要作用。

  如果将CD40放入PubMed搜索引擎中,你会发现有高达14632篇关于CD40的研究文献。尽管CD40在特异性免疫应答的核心作用众所周知,迄今却没有关于CD40表达以及CD40信号通路的系统性的遗传学分析研究;并且关于CD40的转录,CD40 mRNA以及CD40的翻译后修饰是如何被调控这一问题的研究甚少。然而,从以往的研究中我们可以推断,CD40信号通路在B细胞中必定是受到多层级的严格调控的:异常过量表达的CD40易导致自身免疫性疾病以及B细胞淋巴瘤的发生;而CD40表达不足又会导致免疫缺陷性疾病。

  2019年7月30日,美国哈佛大学医学院Benjamin E. Gewurz团队(姜畅博士为论文第一作者)在Cell Reports上发表长文CRISPR/Cas9 Screens Reveal Multiple Layers of B cell CD40 Regulation,运用全基因组CRISPR/Cas9文库高通量筛选与流式细胞分离技术相结合的方法,首次揭示了CD40/NF-kB信号通路在人类B细胞中受到多层级的严格调控。该文章首次报道了之前不为人知的C40/NF-kB信号通路的重要调控分子,是迄今为止对于CD40/NF-kB信号通路正向调节分子和负向调节分子的首次系统性的遗传学研究。

  该文章巧妙的运用了CD95作为CD40信号通路活性的指征。在建立了CRISPR/Cas9全基因组文库sgRNA表达的B细胞后,用CD40L激活B细胞,继而采用流式细胞技术分离出CD95低表达和高表达的细胞群,通过与分离前细胞的比较,筛选出分离细胞群中富集的sgRNA,从而精准鉴定出对应的基因,即CD40信号通路的正向调节分子和负向调节分子。

  第1、众多已知经典NF-kB活化途径成员以及非经典NF-kB活化途径成员都被成功地筛选出来,证明经典NF-kB活化途径和非经典NF-kB活化途径都参与了B细胞CD40信号通路的激活;此外,该结果也佐证了该实验设计的成功。

  第2、文章首次报道了在转录水平上,核泛素连接酶FBXO11的缺失显著抑制了CD40的表达;并提供了分子机制,证明这一过程可能是通过CTBP1和BCL6的上调实现的。此外在条件性敲除B细胞FBXO11的小鼠模型中,CD40水平显著下降,CD40依赖型抗体类别转换显著降低。

  第3、在RNA水平上,CELF1对于维持完整的CD40 mRNA起到关键作用。CELF1的缺失会导致CD40 mRNA丢失第六或第五和第六外显子,从而无法翻译出具有正常功能的CD40蛋白质。此外,CD40 mRNA的表达水平受到RNA m6A甲基化的控制。缺失m6A甲基化导致CD40 mRNA的稳定性显著增强。这是对于CD40 mRNA受到甲基化影响的初次报道。

  第4、在翻译后调节水平上,ESCRT复合体被发现负向调节CD40 信号通路的活性。

  第5、 文章首次报道磷酸酶DUSP10是CD40信号通路的重要反馈负向调节分子。在人类原发B细胞实验中发现,其转录和翻译水平在CD40L的刺激之下显著上升。

  综上,该文章的研究结果为后续的研究提供了非常宝贵的资源,并强调了潜在的制药靶标。对于肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫的治疗具有非常重要的意义。

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