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NF-kb信号通路

发布时间:2019-06-13 17:12 来源:未知 编辑:admin

  NF-kb信号通路_生物学_自然科学_专业资料。NF-KB 与微循环障碍 目前经研究发现。 。 。 。 。发现有四种,今天我代表我们小组给大家讲解其中的一种,即 nf kb 在接下来的十分钟 我们要解决四个问题 1 什么是 NFKB2 他又有怎样

  NF-KB 与微循环障碍 目前经研究发现。 。 。 。 。发现有四种,今天我代表我们小组给大家讲解其中的一种,即 nf kb 在接下来的十分钟 我们要解决四个问题 1 什么是 NFKB2 他又有怎样的结构特征 3 在细 胞中信号是如何进行传导的 4 对生命活动又有怎样的意义 于 1986 年,Sen 等首次从鼠 B 淋巴细胞核提取物在信号通路子-KB(nuclear factor-kappa B,NF-KB)? 蛋白家族是一种多效性的转录因子,可以与多种基启动子部位的 KB 位点发生特异 性的结合从而促进其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖,细胞因子等多种刺激而活化后, 能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。而这些刺激因素及 其调控的因子与微循环障碍的发生、发展均有着密切的关系。本文就 NF-KB 的组成结构,? 活 化调节及与微循环障碍的关系等方面做一综述,以期从一新的角度阐述微循环障碍发生的机制 及改善的途径。 1.NF-KB 的概述 1.1 NF-KB/Rel 蛋白家族及结构 1986 年,Sen 等首次从鼠 B 淋巴细胞核提取物中,发现一种能与免疫球蛋白 K 轻链基因 增强子 KB 序列(GGGACTTTCC)特异结合,调节其基因表达的核蛋白因子,? 称之为 NF-KB。 随后大量的研究又陆续发现了 NF-KB? 家族的其它成员,? 其构成亚基分别是 NF-? KB1 (P50)、NF-KB2(P52)、P65(RelA) 、c-Rel(Rel)、RelB 等,因这些亚基的 N-末端均崐有约 300 个氨基酸残基的 Rel 同源区(rel homology domain ,RHD)? ,? 故统称为 NF-KB/Rel 蛋白家族。 其 RHD 内含 DNA 结合区,二聚体化区和核定位序列,分别具有与 DNA KB 序列结合、与同源 或异源亚基二聚体化以及与 NF-KB 抑制蛋白( IKB )家族成员相互作用并携带核定位信号 (NLS) ,参与活化的 NF-KB 由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。 又根据结构、功能和合成方式的不同,Rel 蛋白分为两类。? 一类为 P50(? NF-? KB1)和 P52(? NF-? KB2) ,? 分别由含有 C-末端锚蛋白重复序列(ahkrin ? ? repeat motif)的前体蛋白 p105 和 p100 通过 ATP 依赖蛋白水解过程裂解而形成。 该类蛋白含有 RHD, 但缺乏转录活性区, 无独立激活基因转录的功能。另一类为 p65(RelA),Rel(c-Rel),Rel B 和果蝇的 dorsal、Dif 和 Relish,它们没有前体,除 N 端的 RHD 外,? 其 C-端有一个或多个转录活性区,具有直接作用 转录设备而激活基因转录的功能。 Rel 蛋白成员间可形成多种形式的同源或异源二聚体,? 如 p50/RelA、? p50/p50、RelA/Rel 1 等, 但并不是都可构成二聚体, 如 RelB 只能与 p50 或 p52 二聚体化, ? 而不能构成同源二聚体。 Rel 间的二聚化作用是其与 DNA 结合的特性所决定的,因为 KB 位点为二元对称结构,二聚体 中的每一成员只与半个识别序列发生作用。而且不同的 NF-KB/Rel? 蛋白二聚体具有不同的结 合 序 列 ( KB 位 点 ) , 因 而 具 有 各 自 的 特 性 。 如 NF-KB 的 KB 序 列 为 十 聚 体 的 5 - GGGRNNYYCC-3,而 p65/c-Rel 二聚体的 KB 序列为十聚体的 5-HGGARNYYCC-3,(H 代表 A,C 或 T,R 代表嘌呤,Y 代表嘧啶) 。这样保证了 NF-KB/Rel? 家族对基因调控的特异性,这种 特异性还与细胞类型、亚细胞结构定位、相互作用的 IKB? 类型及激活的方式等有关。 通常所指的 NF-KB 的组成为 p50/p65 异源二聚体,其几乎存在于体内所有细胞,且含量常常最 高。除 RHD 外,其组分 p50 有很少其它序列,而 P65 则有 250 个氨基酸残基的 C-未端,内含 2-3? 个独立的转录活性区, 有增强靶基因转录激活的作用, 而且 p65 的另一个重要功能是与 IKB 成员直接偶然。 其他的同源或异源二聚体的核因子-KB 在体内含量极少,但可能对某些特定的启动子有 独特和重要的作用。Lehming 等报道存在于淋巴细胞中 p50 同源二聚体能以结构型与 DNA 链 KB 序列结合,对转录起抑制作用。讫今为止的体内外实验发现 NF-KB/Rel 蛋白复合物大多以 这样有二种类型存在于胞浆中: 同源或异源二聚体与 IKB 蛋白家族构成的三聚体; Rel 蛋白 (如 p65? )与未裂解的前体(如 p105)组成的二聚体。信号转导可诱导 IKB? 和 p105? 磷酸化而降 解,? 从而使 NF-KB 活化再由胞浆转核而发挥效应。 1.2 IBK 家族 IKB 蛋白家族成员有 IKBα (MAD-3,pp40)、IKBβ 、IKBγ /p105、IKBδ /p100、IKBε 、Bcl-3 以及果蝇属的 Cactus 等。? 其家族结构特点是均有多个约 33? 个氨基酸的重复序列,? 称为崐 SWI6/锚蛋白重复序列, 主要参与与 Rel 蛋白的 RHD 相互作用。 IKB? 蛋白主要有以下三个部分 构成:1.与蛋白降解有关的 N-末端区;2.能与 NF-KB? 相互作用的内部区(区内含有锚蛋白重 复序列) ;3.称为 PEST 的 C? -端区,? 主要参与“囚禁”NF-KB 在细胞浆中。 1.2.1 IKBα ,IKBβ 主要与含有 p65 和 c-? Rel? 的二聚体具有高亲和力,? 与其它 Rel 蛋白亲 和力低,是体内 NF-KB(p50-p65)的主要调控抑制蛋白。IKB? α 的基因启动子上有 KB 位点, 故其合成也受到 NF-KB 的调控,因此形成对 NF-KB 的负反馈调节。IKBβ 则无这种机制。这 种调节差异可致 NF-KB 调控的靶基因的表达表现在时间上和水平上的差异。 1.2.2 IKBγ , IKBδ 作为 p50 和 p52 蛋白前体的 p105 和 p100, 由于在结构上有能与 RHD 相互 作用锚蛋白的重复序列,在功能上有类于 NF-KB 抑制剂的作用,因此将之归于 IKB? 家族,? 2 称为 p105/IKBγ ,p100/IKBδ 。例如:p105 既含有在 N-未端区的 p50,又含有 3-4? 个锚蛋白重 复序列的 C-未端区,因而它既能掩蔽 p65、c-Rel,又可以通过蛋白水解释放出 p50。 1.2.3 IKBε ,Bcl-3 IKBε 主要与 p65 发生抑制作用,专一性地与 p65 和 c-? Rel 结合,与 IKB α 具有多方面的共同特性。Bcl-3 位于胞核,虽然表现出能抑制含有 p50? 的二聚体,但与 p52 在 DNA 上结合后却发挥了转录共激活的功能。 1.3 NF-KB 的活化信号转导途径 非活化状态的 NF-KB 以与 IKB 聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体的形式存在 于细胞浆中,在多种因素的刺激作用下,通过多种信号转导途径使 IKB 磷酸化,再在蛋白水解 酶作用下发生降解, 从而使 NF-KB 得以活化而转核发挥其调控作用。 ? 这个过程大致分三部分: 1.3.1 刺激因素的信号转导:多种因素如细胞因子(TNF-α 、 IL-1β 、IL-2) 、病毒(流感病毒、 ? 鼻病毒) 、双链 ANA、氧化剂、细菌脂多糖、多种抗原及紫外线照射等均是 NF-KB 活化的刺 激信号, 能通过多种不同的信号转导途径, 由胞外向胞内传递, 使 NIK (NF-KB-inducing kinase) 或活化途径中的其它激酶激活,而致 NF-KB 的活化。 Cao 等提出 IL-1 的活化途径是:IL-1 与胞膜上的 IL-1 受体(IL-1R)识别结合后,IL-1R 胞 浆内组份立即与 IL-1R 辅助蛋白(IL-1R accessory protein,IL-RAcP)联结,IL-1RAcP 再聚集活 化一种接合体蛋白髓细胞样分化蛋白(Myeloid differentiation protein MyD88),MyD88 再聚集两 种丝氨酸/苏氨酸激酶: IL-1 受体活化激酶 (IL-1 ? receptor-? activated ? kinase IRAK) ? 和 IRAK2 而共同形成受体复合体。 IRAK、 IRAK2 又随后又跟一种接合体分子 TNF? 受体结合因子 6 (TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)相互作用。TRAF-6 使 IRKA、IRAK2? 与 NF-KB 诱导激酶 (NF-KB-inducing kinase NIK)相联结,NIK 被激活。zhang 等则通过实验证明,LPS 与其受体 结合后要通过 IL-1 的浆内信号介导途径激活 NIK.从而活化 NF-KB 的。 而 Takeuchi 等揭示 TNF? 激活 NIK? 是通过 TNF? 受体、TNF 受体结合死亡区? (TNF ? reeeptor ? associated ? death ? domain,TRADD) 、TRAF2 及丝氨酸/苏氨酸激酶 RIP 的过程。 双链 DNA(double-stranded DNA,dsDNA)和佛波酯(PMA)则分别通过 dsDNA 依赖的蛋白 激酶(dsDNA-dependent? protein kinase, PKR)和 PKC、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK-PP90rsk) 来使 IKB 磷酸化。 1.3.2 IKB 的磷酸化及降解 NIK 属于丝裂原激活蛋白激酶 MAPKKK 家族的。NIK 活化 IKB 激酶复合体 IKKα 、IKK β , IKK α 、 IKK β 催化 IKB? 上 Ser32/36 磷酸化 ,? 然后 IKB? 上 Lys21/22 遍在 ? 蛋白化 3 ( ubiquitination ) , 再遍在蛋白连接酶( ubiquitin conjugation enzymes )作用下与蛋白酶小体 (proteasome)连接,? 在蛋白酶小体作用下 IKB 降解,NF-KB 活化。 1.3.3 NF-KB 核转位及调控基因表达。 IKB 降解后,暴露 NF-KB 上的核定位信号,NF-KB 迅速发生转核,与调控基因启动子上 的 KB 位点结合,启动基因转录。 2.NF-KB 在微循环障碍发生发展中的作用。 NF-KB? 活化后能调控一系列基因的表达:如粘附分子家族的细胞间粘附分子- 1? (intercellular adhesion nolecule-1,ICAM-1) 、? 血管细胞粘附分子-1(? vascullar cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、E-? 选择素(E-? selectin)? 、? p-? 选择素(P-selectin)前炎症性细胞因 子 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-2、 IL-6, 化学趋化因子单核细胞趋化蛋白-1 (Monocyte chemoattoactant protein-1,MCP-1) 、IL-8? 以及一些受体分子 IL-2 受体、T 细胞受体α 、β 链,等等。? 而这些 物质都能直接或间接地作用于微血管内皮细胞或血细胞或者介导它们之间的相互作用,从而导 致微循环障碍。 2.1 NF-KB 介导的微管内皮细胞的损伤。 2.1.1 炎症性浸润引发的损伤 已知 ICAM-1 基因启动子上有1个基本的 NF-KB 位点, VCAM-1 基因有 2 个 NF-KB 位点,E-sel 基因有 3 个 NF-KB 位点。在 TNF、IL-1、LPS? 及活 性氧作用下,能在 30min 内使 NF-KB 活化升高,并且持续很长时间,? 然后单独或与其它因子 协同作用下,使 ICAM-1、VCAM-1、E-sel 在 2-4 小时内表达增加,6-12 小时内达到峰值,而 且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖的方式。不同途径抑制 NF-KB? 的活化或清除刺激 来源后,均能相应地抑制这种活化和表达。ICAM-1、VCAM-1、E-sel 能与白细胞表面的配体相 应地结合,介导白细胞的贴壁粘附,致白细胞聚集、浸润,从而导致局部炎症的发生,微血管 内皮细胞损伤,表现为微血管通透性增加、组织水肿等,微循环障碍发生。 ? ? P-sel? 又名血小板活化依赖颗料表面膜蛋白 (Platelet ? activation dependent granule-external membrane,PADGEM 或 GMP-140) ,? 参与介导内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的粘附。研究 表明在鼠 P-sel 基因启动子上-218? GGGGGTGACCC(? -207)处有 KB 位点,TNF-α 、LPS 刺激 下,NF-KB 与结合 cAMP? 反应元件的核因子协同促进 P-sel 基因的表达,在 2h 时能检测到这 种增高。 NF-KB 通过调控 IL-8 及 MCP 等化学趋化因子的表达,从而募集大量的单核巨噬细胞、中 性粒细胞,引发炎症浸润和损伤。Ping 等认为在 LPS、TNF-α 促进 MCP 的表达中,p65 是必 4 需的 Rel 家族蛋白,而 Stylianon 则指出 Mcp 上的两个 KB? 位点A1 和A2 中 c-Rel 只与 A2 结 合,而且在 IL-1 刺激 MCP 表达过程中,出现 c-Rel-p65? 和(p65)2 选择性反式作用于 A1、A2 位点的现象。 NF-KB 还能促进 IL-2 受体,T 细胞受体α 、β 链的表达,从而介导了 IL-2 的毒性损伤以 及 T 细胞与内皮细胞粘附,导致内皮细胞受损。 2.1.2 NF-KB 活化后促内皮细胞的凋亡,致微血管损伤。 NF-KB 的活化能诱导内皮细胞的凋亡, 主要有以下几种方面的证据: ⑴在许多促调亡基因: C-myc、TNF 及 IL-1 转化酶(IL-1 converting enzyme,ICE)启动子上都发现了 KB 位点。⑵TNFα 诱导凋亡中出现了 NF-KB 的伴随活化。⑶胸腺细胞能活化 NF-KB 而诱导细胞凋亡。⑷通过 清除 NF-? KB? 的诱导物活性氧(reactive oxygen species,ROS)能抑制凋亡的发生。 也有研究表明在恶性肿瘤,变态反应和自身免疫疾病中, NF-KB 通过上调凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis,IAP)而抑制瘤细胞等的凋亡,? 从而加重了疾病的发生,这可能与 Rel 家族不同成分及不同的刺激、信号途径有关。 2.2 NF-KB 活化影响凝溶的平动态衡,促微血栓形成。 2.2.1 NF-KB 活化促进 vWF(von Willebrand Factor)的表达。vWF? 是Ⅷ因子的相关因子,它与Ⅷ 因子结合,能有效防止Ⅷ在血浆中迅速降解。VWF 与Ⅷ结合,组成 FⅧ/VWF,一端与血小板 糖蛋白 Ib 结合,另一端与内皮细胞下的胶原纤维连接,介导血小板粘附血管内皮,促进微血栓 形成。Keightley 报道 p50 能与 VWF? 启动子结合,从而影响血液中 vWF 水平。镰刀型贫血病 时高水平的 vWF 介导镰刀型 RBC 的聚集及与内皮细胞的粘附,并且促进血小板内皮细胞粘分 子(platelet-endothelial ? cell adhesion molecule-1,PECAM-1)的磷酸化,抑制 NF-KB 则明显改 善这些指标。 2.2.2 NF-KB 调控内皮细胞合成组织因子(Tissue factor) ,这是一种亲脂性蛋白能作为受体与Ⅶ 因子和Ⅶa 结合而形成复合物,使 IX 和 X 裂解,从而既激活外凝系统又激活内凝系统。IL-1、 LPS、TNF 均能通过刺激 NF-KB 促进其的合成,在 2h 达到峰值,且存在时间,剂量依赖性, 已在内毒素血症 DIC 的发生发展中得到证实。 2.2.3 NF-KB 对纤溶的影响 纤溶与抗纤溶在正常情况下维持动态平衡。 但纤溶酶原激活抑制物 -2 (Plasminogen activator inhibitor type-2,PAI-2) 启动子上有两个 KB 位点。 TNF-α 能刺激 NF-KB 促 PAI-2 的表达。Dechend 也报道动脉粥样硬化时内皮细胞产生的 PAI、组织因子等促凝血蛋白 质的升高伴随着 NF-KB 的活化。 而 p65? 的持续活化则能促进 uPA (urokinase-type PA) 的表达, 5 因为 uPA? 启动子上也发现了一个 KB 位点。NF-KB 的活化能紊乱微血管的纤溶系统。 2.3 NF-KB 在微循环障碍中的自我调控 2.3.1 NF-KB 经细胞外的正反馈调节:NF-KB 活化后,可增强 TNFα 、IL-1? β 、IL-2 的基因 转录,TNF-α 、IL-1β 、IL-2? 产生和释放增多,? 进而再次激活 NF-KB;同时还可使 IL-6、 IL-8 等这些前炎症因子产生、释放增多,从而导致最初的炎症信号进一步放大,加重机体损伤 及微循环障碍,直至 DIC 或死亡。? 这种情况多见于脓毒综合征(sepsis syndrome)和急性呼吸 窘迫综合征(ARDS)等。但通常这种情况在机体内不是这样无止境无限制的,因为 NF-KB 有负 反馈调节。 2.3.2 NF-KB 经细胞内、 外的负反馈调节: ⑴在胞内 NF-KB? 活化后除启动炎症介质基因转录外, 同时还上调 IKBα 、Bcl-3 以及具有双重功能的 p100、p105 前体蛋白,这些新增加抑制蛋白,能 迅速在核内或核外重新灭活活化的 NF-KB。从而终止炎症介质的转录,限制急性炎症反应。其 中 IKBα 的效果最明显,NF-KB 在活化后 30min 就有了 IKBα 的合成,因而单纯刺激 IKBα 的磷 酸化只能引起短时相的 NF-KB 的活化。IKBβ 的合成不受 NF-KB 的调控,因此 IKBβ 磷酸化 能引起 NF-KB 长时相的活化。 故若缺乏 IKBα ,则易引起广泛的全身性炎症。此外 NF-KB 的 活化也使 p50 同源二聚体生成增多,此种二聚体不能被 IKB 有效结合,并缺乏转录激活区。? 易位至细胞核后,可与 NF-KB 竞争性结合 KB 序列,抑制 NF-KB 的活性。 ⑵在细胞外,LPS、TNF-α 和 IL-1β 能刺激反向调节细胞因子 IL-10 的产生,IL-10 能阻 止单核细胞中内毒素诱导的 NF-KB 的活化,从而限制急性炎症反应,? 缓解微循环障碍。 NF-KB 能促进 Mn SOD (manganese superoxide dismutase ,MnSOD) 及 iNOS(inducing nitric oxide synthase,iNOS)的表达。MnSOD 启动子上有 KB 位点,LPS、? ROS 刺激下,NF-KB 和 C/EBP、NF-1 等共同作用,促进 MnSOD 的表达,从而清除自由基,抑制 NF-KB 活化,减少自 由基的损伤作用。 蛋白酶抑制剂 MG341、 TLCK 能抑制 IL-1 诱导的 iNOS 的升高, 通过抑制 IKB 的降解过程。 展望: 微循环障碍广泛发生于临床各种疾病、创伤及某些生理应激情况下,其发生不仅是局部或全 身组织器官的损伤的标志,而且持续的微循环障碍更加重了疾病的发生、发展及预后。因此通过 抑制 NF-KB 的激活,从而阻断 NF-KB 调控的炎症反应,缓解微循环障碍,减轻机体组织的损伤, 正日益成为研究的热点。 当前实验研究从基因治疗、蛋白激酶抑制、免疫抑制及抗氧化几个途径着手来抑制 IKB 的降解 6 或直接抑制 NF-KB 的活性,已经取得了一定的突破,并且对糖皮质激素、阿司林、Vc、Ve 等的 抗炎症、抗氧化损伤机制提出了新的药理认识,指导了临床应用。相信将来能更尽一步弄清 NF-KB 的活化及调控机制,从而能够实施针对性、? 特异性治疗。 NF-kb 探针 5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’ 3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’ NF-κ B 一般以同源或异源二聚体形式存在,激活后与靶基因上特定的 DNA 序列(κ B 位点, 其核心序列为 GGGRNNYYCC,R:嘌呤 Y:嘧啶 N:任意碱基)结合并调节基因转录。只要 有这段核心序列就行,无种属差异。 NF-κB-类风湿关节炎的治疗靶标 前言:类风湿关节炎(RA)是世界性疾病,在我国也是一种常见病,患病率约为 0.3%。这种系统性慢性炎症性疾病是一种复 杂的自身免疫病,目前公认的 RA 是由不明抗原介导免疫的反应,导致自身抗体产生,RA 以炎症细胞浸润滑膜及大量炎症介质 产生,非化脓性增生性滑膜炎为特点,逐渐导致关节软骨的破坏,最后造成关节功能的障碍,并可伴有关节周围软组织及其它器 官的损害。核转录因子 NF-kB 是一种多极性基因调控蛋白,能调节多种参与免疫反应的细胞因子、炎症介质、粘附分子、及蛋 白酶类的基因转录过程,从而控制它们的生物合成。NF-kB 能够参与免疫细胞的分化,增殖,和活化。NF-kB 在参与某些细胞 的生长调控以及抗细胞凋亡方面亦起着重要的作用,因此 NF-kB 在RA发病的多个环节中起重要作用,所以,抑制 NF-kB 活性 为临床治疗各种 RA 提供了一条新的治疗性干预途径,同时也为筛选新型治疗RA的药物指明了前进方向。 一)NF-kB 系统的组成 1). NF-kB 系统的组成 NF-kB 系统几乎存在于所有细胞中,由 NF-kB 家族及其抑制物 I-kB 家族共同组成[1]。NF-kB 家族由 Rel 蛋白家族中的成员以 同源或异源二聚体的形式存在。 在哺乳动物细胞中有五种 NF-kB /Rel 家族成员: RelA(P65), RelB, C-Rel, NF-kB 1(p50), NF-kB 2(p52)。每个家族成员含有一个由 N-端 300 个氨基酸组成的保守的 Rel 同源结构域(RHD)负责 DNA 结合、二聚化、核定位 及与 I-kB 抑制性亚单位相互作用,其中 P65 含有转录活化区域。尽管存在多种 Rel 家族成员,但习惯上通常把由多肽 p65 和 p50 两个蛋白亚基组成的同源或异源性二聚体称为 NF-kB,其中异源性二聚体活性较强,在 NF-kB 异源性二聚体中,虽然二种 亚单位均能与 DNA 结合,但只有 P65 在蛋白的 C 末端含有转录激活区域,能直接作用于转录元件而激活转录过程[2-3]。静息 时 NF-kB 二聚体与 I-kB 蛋白家族构成三聚体而存留于胞浆,当细胞受到外界因素,如细菌或病毒感染、炎症细胞因子、TNF、 LPS、紫外线照射、电离辐射等刺激后,I-kB 将发生磷酸化并迅速降解,NF-kB 被释放, 、激活并进入细胞核,结合于特异性 7 DNA 位点,从而启动一系列基因的转录,发挥其重要的生物学作用[4]。IκB 蛋白家族是 NF-κB 的抑制物,目前已知包括 I-kBα、 I-kBβ、I-kBγ/p105、I-kBδ、I-kBε、Bcl-3、P100 等成员。该家族成员分子中均含有 5-7 个约含 30 个氨基酸的锚蛋白重复序列, 这是 I-kB 与 NF-kB 相互作用的结构基础。I-kB 通过非共价键掩盖 NF-kB 的核定位信号(NLS)而阻止 NF-kB 的核转位。 2) .NF-κB 的激活过程 主要分三步:1. NF-kB 的诱导剂通过细胞膜激活胞浆中的 IκB 激酶,使 IκBα 在 32、36 位丝氨酸的磷酸化,磷酸化的 IκB 接着 被 lys21、lys22 上被泛素化,泛素化的 IκB 迅速被 26S 的蛋白酶体降解,NF-κB 游离于胞浆中;2. 胞浆内游离的 NF-κB 移位 至胞核内,与 DNA 分子靶基因中启动子区域的 NF-κB 结合位点相结合;3. 启动靶基因转录,生成相应的 mRNA。这一过程相 当迅速,无需蛋白质合成。哺乳动物细胞转染实验证明 IκKα 和 IκKβ 是 NF-κB 激活途径的关键酶。 3) .NF-κB 的激活剂与抑制剂 目前发现多种因素可诱导 NF-κB 活化。①前炎性细胞因子,如 TNFα、IL-1;②与细胞分裂、增殖有关的因素,如抗原、植物 血凝素(PHA) 、刀豆素 A(ConA)和佛波酯(PMA) ;③细菌毒性产物 LPS、病毒、双链 RNA 等;④物理化学因子,如紫外线、 吐根碱、放线菌酮等;⑤致凋亡因子,如离子射线、化疗药物。在众多因素中活性氧产物在介导 NF-κB 活化中可能起重要作用。 NF-κB 的激活也能被多种因素抑制。[5-6] ①免疫抑制剂,如糖皮质激素、环胞素、水杨酸、阿斯匹林;抗炎症因子,如 IL-1、 IL-10;③抗氧化剂,如乙酰化胱氨酸、花生四烯酸、吡硌烷双硫脲、倍半萜内酯;④其他,如木霉素、cAMP、IκKα、NO、A20。 ⑤植物药物是开发 NF-κB 抑制剂的宝库, 有人研究了通过 NF-κB 信号转导通路发挥抗炎作用的药用植物, 发现余甘子、 蒙自桦、 当归藤、扁担藤、独子藤、香须树生药的提 取物可以抑制 NF-κB 向核内易位。[7]有人也发现银杏[8]、姜黄素等多种天然植物药物可以抑制 NF-κB 活性[9]。 二)NF-κB 的生物学功能 1) .NF-κB 参与调节的基因 受 NF-κB 调节的基因包括①细胞因子与生长因子,如 IL-2、3、6、8、12、IL-1β、TNFα、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO 等; ②免疫受体,如免疫球蛋白 κ 轻链、T 细胞受体 α、β 链 MHC-I、II、β2 微球蛋白等;③粘附分子,如细胞间粘附分子 1、血管 细胞粘附分子 1、内皮细胞白细胞间粘附分子等;④急性期蛋白,如血管紧张肽酶、补体因子 C4、补体因子 B 等;⑤转录因子 及调节子,如 C-Rel、P105、IκBα、A20 等;⑥炎症酶,如诱导型一氧化氮合成酶、诱导型环加氧酶、胞质磷脂酶等;⑦病毒, 如 HIV 1、HIV-2、CMV、ADV、SV-40 等;⑧其他,如穿孔素、波形纤维蛋白、核心蛋白聚糖。反过来,由 NF-κB 调节的产物, 如 TNFα 和 IL-1β 又能激活 NF-κB。这意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。NF-κB 并不是调节这些炎症 和免疫基因的唯一转录因子,但它与其他转录因子如活化蛋白-1(AP-1)共同起着中心调节作用[10-12]。 2) .NF-κB 与淋巴细胞 NF-κB 能够参与免疫细胞的分化,增殖和活化 NF-κB 能够参与免疫细胞的分化,增殖和活化[13-16],B 细胞的生长发育受免疫 球蛋白基因的有序调控, 而 NF-κB 在 B 细胞中的一个重要作用就是调节免疫球蛋白 κ 链基因表达, 前 B 细胞一般不表达活化的 NF-κB,只有其发生分化时才能表达活化的 NF-κB [17] 。成熟的 B 细胞系大部分以 P50-C-Rel 异源二聚体形式存在,而此二聚 8 体与 P50-RelA 二聚体一样能有效地激活 Igκ 基因的表达。利用“敲除”技术研究发现,在缺乏 p50/p105 亚基的小鼠,出现 B 细 胞系的免疫反应缺陷,其 B 细胞在 LPS 刺激下产生抗体的能力明显下降 [18] 。而在人类至今沿未见 NF-κB 缺陷所导致的免疫 功能低下相关疾病的报道。 NF-κB 在 T 细胞的增殖活化过程中亦发挥重要作用: 对 T 细胞增殖最为关键的细胞因子 IL-2 及其受 体 a 链的基因增强子上均有 NF-κB 的结合位点,其表达直接受 NF-κB 调控;在 CD2/CD28 协同刺激的 T 细胞中,NF-κB 特异 性阻断 PDTC,在阻断了 NF-κB 活化的同时亦抑制了 T 细胞的增殖和有关因子的生成[19-23] 。.. 3) .NF-κB 与细胞因子 NF-κB 参与调控一系列重要免疫因子的表达(见前文) ,这此免疫因子对免疫细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着 直接的调控作用。因此,NF-κB 在免疫系统在可能有着举足轻重的地位,是许多免疫炎症相关基因转录调控的枢纽,通过影响 免疫细胞内 NF-κB 的活性有可能直接调控机体的免疫状态。 4) .NF-κB 与凋亡 NF-κB 在参与某些细胞的生长调控有及抗细胞凋亡方面亦起着重要作用。 自 1996 年ANtwerp[24]发现 NF-κB 能够抑制由 TNFα 诱导的细胞凋亡有来,这方面的研究在不断深入,目前认为,NF-κB 主要通过以下三条途径来抑制细胞凋亡[25-29],(1)通过 调控细胞因子而参与自身及其它细胞的凋亡; (2)通过诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡; (3)通过诱导 TNF 受体相关因子和 凋亡抑制蛋白抑制凋亡。 三)NF-κB 与RA炎症,增殖及组织破坏 1) .RA 患者的主要免疫学异常 1.体液免疫: RA 患者体液免疫处于激活状态,表现在关节腔中出现大量浆细胞,外周血中 CD5+B 细胞(B1)比例明显增高。 激活的 B 细胞可产生包括 RF 在内的多种自身抗体。自身抗体参与 RA 发生的可能机制是:自身抗体与自身抗原结合为复合物, 激活补体和激肽系统,并刺激炎性细胞因子产生,从而导致组织损伤。 2.细胞免疫:一般认为 RA 的发生和演变由尚未明确的抗原性肽类激活的 T 细胞所介导。RA 关节滑膜中浸润大量 T 细胞,约占 滑膜细胞的 20%-50%,其中以 CD4+T 细胞为主。激活的 T 细胞可产生 IL-2、IL-4、IFN-γ、LT 等细胞因子,参与 RA 病变的 持续进展。 3.细胞因子:RA 患者关节液和滑膜组织中存在多种细胞因子,包括 T 细胞产生 IL-2、IL-4、IFNγ、LT 等和单核/巨噬细胞产 生的 IL-1、IL-6、IL-8、TNFα、GM-CSF、TGF-β、LIF、血管生成因子等。目前认为,IL-1 和 TNF-α 在导致 RA 滑膜炎症中起重 要作用。 4.凋亡异常: RA 的特点是关节软骨破坏,重塑,增生和慢性滑膜炎[30-31]。独有的成纤维细胞应答 TNFα 后产生基质溶解素 和明胶酶,滑膜炎与这种独有的成纤维细胞增生有关[32],人们认为这些成纤维细胞对关节软骨起直接作用,是导致软骨和骨 破坏的重要细胞。目前认为侵蚀性成纤维细胞无法控制地增生机制生长与凋亡之间失去了平衡。 2).RA 中 NF-κB 处于激活状态 在人类RA早期、晚期炎症关节的滑膜组织中均可以检测到 NF-κB 的活化[33],滑膜植块的核提取物分析表明RA病人存在 9 NF-κB DNA结合活性升高,而骨关节炎病人则没有[34]。免疫组化研究显示 RelA(p65)和 NF-κB1(p50)大部份位于 RA 内皮细胞和滑膜层,尤其是 CD14 阳性细胞,而正常滑膜则未染色[35]。用抗活性 NF-κB 抗体(与IκB 分离)进行免疫染色也 得到类似的结果,活性 NF-κB 存在于滑膜层的巨噬细胞样滑膜细胞核内以及血管内皮细胞中。Miyazawa 等人利用 NF-κB 报导 基因体外分析RA原代成纤维样滑膜细胞的单克隆的 NF-κB 依赖的转录, 在一些克隆中检测到 NF-κB 的活性成分, 值得注意的 是,这些克隆自发产生大量的 IL-6[36]。这些证据表明 NF-kB 活化是人类 RA 滑膜的共同特点。在多种 RA 的动物模型中也检 测到 NF-κB 活化,如大鼠佐剂性关节炎[37],异十八烷和链球菌细胞壁诱导的大鼠关节炎[38-39],胶原诱导的小鼠关节炎[40]。 3). NF-kB 与滑膜炎症 自身免疫应答形成持续的、自我永存的炎症反应,RA 慢性炎症开始与自身免疫应答的形成有关。实验证据表明 NF-kB 的活化 在 RA 的发病初始及慢性炎症的持续期起重要的作用。 4). NF-κB 在慢性炎症的初始 抗原递呈细胞(APC)与T细胞相互作用导致二者 NF-κB 激活,T 细胞受体和 CD28 与 APC 递呈的配体,MHCⅡ,共刺激分子 CD80 和 CD86 结合触发 NF-kB 活化。T 细胞受体和 CD28 协同诱导T细胞激活和增殖所需的 NF-κB 依赖性基因,如 IL-2, IL-2R,IFNγ [41-42]。随后活化的 T 细胞引发 APC 的激活。活化的T细胞表达 TNF 超家族,CD40L,TRANCE 或 ODF(造骨细 胞分化因子) , 它们与 APC 受体 CD40 和 RANK 诱导 NF-κB 活化, 提高 APC 存活和增殖能力, 通过上调NF-κB 依赖性分子 MHC Ⅱ,共刺激分子 CD80 和 CD86,刺激T细胞增殖与活化[43-46]。 通过小鼠的观测到了 NF-kB 在免疫应答中的重要作用,RelB 和 NF-kB2 在 relb –/– 和 nfkb2 –/– 小鼠中失活导致 APC 功能受损,NF-kB1 和 c-Rel 在 nfkb1 –/– 和 rel –/– 小鼠中缺失 导致 T、B 细胞活化的多种缺陷,以及对致病原应答减弱[47]。 5) .NF-kB 促进 Th1形成 T 细胞活化后 CD4+Th 细胞能够分化成 Th1 或 Th2 亚型。它们分别产生不同的细胞因子,调节不同的免疫应答: Th1((IFNγ 和 IL-12 优势)细胞介导细胞免疫,激活巨噬细胞,通常认为具有促炎性作用:Th2 (IL-4 和 IL-5 优势) 细胞具有抗寄生虫和体液 免疫,抑制巨噬细胞活化作用。通常认为具有抗炎作用。由于.NF-kB 控制Th1 型细胞因子 IL-2,IFNγ,IL-12 的表达,因此 NF-kB 激活促进Th1型细胞形成。实际上,在表达 NF-kB 抑制剂(I-kB 不降解突变体,也称为超阻遏物I-kB)转基因鼠观 察到Th1应答降低,而Th2升高[48-49]。T细胞表达Rac2(NF-kB 上游激活剂)的转基因鼠相应的形成Th1型应答[50]。 6) . NF-kB 与慢性炎症的持续 活化的T细胞分泌产物通过细胞与细胞间的作用诱导激活巨噬细胞,巨噬细胞是RA滑膜炎型细胞因子的主要生产者。IL-1β、 TNFα 是 RA 炎症的重要介质,NF-kB 控制它们的表达。IL-1、TNFα 是有效地诱导激活剂,这说明 NF-kB 持续活化与 NF-kB 与 一定水平的 IL-1、TNFα 相互依赖,实际上 srI-kB 不能诱导人巨噬细胞和原代 FLS 产生 IL-1β、TNFα[50-52]。 Aupperle 等 人近来研究发现 IKKβ/IKK2 是 NF-kB 应答 IL-1β、TNFα 的而活化的主要激酶,IKK-2 的 DN 突变体抑制细胞因子诱导的 NF-kB 激活,使 IL-6、IL-8、ICAM-1 和胶原酶-1 无法合成。相反 DN IKKβ/IKK1 则没有此作用[53]。IKK 基因敲除鼠表明 IKKβ/IKK2 是细胞因子诱导的 NF-kB 激活的主要途径[54]。 10 通过抑制 NF-kB 可以抑制多种前炎性细胞因子的表达,IL-1、TNFα、L-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1,但对抗炎性细胞因子 IL-10、 IL-2 受体拮抗剂几乎没有作用[55-57]。说明 NF-kB 活化可促进炎症关节内的促炎性因子与抗炎性因子失衡。 7) . NF-kB 与增生 正常滑膜仅有 1-2 层滑膜细胞,而 RA 滑膜则可增厚达 3-7 层,形成侵蚀性,肿瘤样的血管翳,它侵袭、破坏关节实验证据表 明 NF-kB 活化可以通过促进 RA FLS 增生,抑制 FLS 凋亡,从而出现滑膜增生。 6.1 增生 NF-kB 诱导 c-Myc 和 cyclin D1, 细胞周期循环所需蛋白的表达,在破肌细胞和纤维细胞的生长中起阳性调节作用 [58-60]。 Makarov 等人研究大鼠原代 FLS 发现用血小板源的生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子刺激后可诱导 NF-kB 活化, NF-kB 活化是 c-Myc 和 DNA 合成所必需的[58]。相反具有丝裂原活性的胰岛样生长因子-1 不能激活 NF-kB,也不为 NF-kB 抑 制剂所影响(未发表) 。NF-kB 在 FLS 丝裂原保护细胞免受 c-Myc 的细胞毒性。尽管增殖需要 c-Myc,但是除非存在一定的存活 因子,否则 c-Myc 会导致细胞死亡。PDGF 就是这样的因子,它能够对抗 c-Myc 的促凋亡倾向。Makarov 发现阻断 NF-kB 会导 致 PDGF 的保护作用丧失,这说明在 PDGF 途径,NF-kB 传递两种信号,一是诱导 c-Myc 所需的,另一个是抗凋亡信号,中和 c-Myc 的细胞毒性, 可以认为是诱导产生了一个或多个保护性基因[58]。 c-Myc 在 RA 滑膜中过度表达, NF-kB 活化后抑制 c-Myc 诱导的凋亡,促进滑膜增生增殖。有重要意义的是 PDGE 诱导的 NF-kB 活化涉及到磷脂酰肌醇-3 激酶﹛PI(3)K/Akt﹜,和蛋白 激酶 B/Akt, 目前已经清楚 PI(3)K/Akt 途径涉及多种人类恶性疾病的发病过程,这说明 RA 和肿瘤在增生形成方面有相似的机制。 6.2 凋亡 很多促凋亡刺激物,如 TNFα,射线、化疗能够激活 NF-kB,在大多数细胞中 NF-kB 传递抗凋亡信号。NF-kB 抑制凋亡表明它 激活了抗凋亡基因,包括 TRAF1 、 TRAF2、c-IAP1 、c-IAP2、 Bcl-2 同源 A1/Bfl-1 和 Bcl-xL、IEX-1、 XIAP [61]。阻断大 鼠原代 SCW FLS NF-kB 活化能够大大地增强 TNFα 和 FasL 的细胞毒性,与此一致,体内使用不同的 NF-kB 抑制剂,如蛋白酶 体 抑制剂、srI-kBα 的腺病毒转基因结构,能够加速异十八烷及 SCW 诱导的大鼠关节炎关节内的凋亡[50]。zhang 等人与此 观点一致,他们在人 RA/SCID 鼠模型中观察到 NF-kB 活化能够对抗 TNFα 对 RA FLS 的细胞毒性,大概是通过诱导抗凋亡蛋白 XIAP 来实现的[60]。这些结果表明 NF-kB 可能是通过抑制 TNFα 和 FasL 的细胞毒性在防止 RA FLS 发生凋亡中起了重要作用。 因为在 RA FLS 中 TNFα 是一种有力的丝裂原,所以 NF-kB 是以一种重要开关的形式决定 TNFα 是执行丝裂原还是促凋亡的作 用。前面提到 PI(3)K/Akt 途径在肿瘤细胞的存活和增殖方面具有显著作用,NF-kB 是其中重要的环节。实验表明 PI(3)K/Akt 途径可以对多种刺激物产生应答,如 PDGF [58]、TNFα[63]、IL-1 [64]、 bradykinin [65]、 致癌性 H-Ras [66] 、Her-2/neu [67]。调节 NF-kB 活化。Akt 依赖性 NF-kB 活化能够调节 PDGF[58]和 Her-2/neu [67]的抗凋亡功能,通过下调 c-Myc [58]、 H-Ras [66]、NFα[67]。制细胞死亡。Akt 如何精确激活 NF-kB 依赖性转录依然有不少争论。一些小组认为与 IKK 有关,因此涉 及到 NF-kB 依赖性机制 [63,65,67,68,69],另有些学者认为是 NF-kB 非依赖性机制,是 Akt 使 NF-kB 具有了转录功能[64,66]。 Akt 与 NF-kB 的连接机制及 NF-kB 途径在 Akt 抗凋亡功能中的作用很有可能与细胞和刺激物类型有关。 Akt 在 RA 发病机制及在 RA 滑膜中对 NF-kB 活化的作用尚不清楚,但照理看二者之间肯定按存在联系,值得进一步探讨。 11 NF-kB 与组织改型 目前认为 RA 关节破坏主要是 FLS 的作用,RA 关节炎性环境造成了 FLS 的侵蚀性表型,有证据说明 NF-kB 活化为 FLS 提供了 破坏能力。首先,NF-kB 调节一些基质金属蛋白酶(MMP)的活化,MMP-1 的启动子具有 NF-kB 结合位点,它是通过 IL-1β 刺激 MMP-1 产生所必需的[70]。而且 NF-Kb 活化是引发 MMP-3、 MMP-9、MMP-13 表达所必需的 [71-73]。第二,COX-2 和 诱导型 NOS 催化前炎性因子前列腺素和 NO 代谢物的合成,NF-Kb 活化对引发 COX-2 和诱导型 NOS 是必需的[74]。 最后, NF-kB 活化是引发血管内皮细胞生长因子所必需的,此因子是内皮细胞特异性丝裂原,是 RA 血管炎中重要的调节因子[75]。 RA 中破骨细胞 NF-Kb 活化在关节破坏中起着显著的作用,NF-kB 依赖性细胞因子 IL-1α、 IL-1β、TNFα、 IL-6、IL-17 升高, 骨髓源性的破骨细胞前体由此被募集到 RA 滑膜[76-77]。 在佐剂性关节炎动物模型中发现活化的 T 细胞和破骨细胞/ 间质细胞表达高水平的 TRANCE/RANKL/ODF,促进破骨细胞成熟, 具有骨吸收活性,而骨保护素是 RANKL 受体的可溶性诱骗物,能够阻止破骨细胞分化和骨质流失[44,78]。通过观察 nfkb1 –/–nfkb2 –/–双敲除小鼠发现了 NF-kB 在骨更新中的重要作用,这种小鼠由于不成熟破骨细胞的大量累积而形成了骨硬化病 [79]。 四).NF-kB 作为治疗的靶标 NF-kB 是各种炎症反应的共同通路,可以作为进行干预治疗的重要靶点[80]。目前很多的抗炎和抗风湿药,如糖皮质激素、阿 斯匹林 [81] 、柳氮磺吡啶[82] 、金制剂[83] 、来氟米特[84-85]、FK506、环孢素 是 NF-kB 活化的抑制剂[86]。通过抑制 NF-kB 活化起作用的药物还包括很多天然的或合成的抗氧化剂、免疫抑制剂、天然植物药物。这说明它们的治疗效果至少部分 是通过抑制 NF-kB 活化而起作用的[87]。但是也有相当多的药物不是 NF-kB 活化的抑制剂,这是因为它们能够影响其他的信号 途径。NF-kB 信号途径失活的转基因动物,如 rel –/– 和 nfkb1 –/– 敲除鼠的 c-Rel 和 NF-kB1 失活,使其不能形成 CIA[88]。 T 系淋巴细胞表达 srIkBα 的转基因鼠与之类似也不发展成为 CIA[89],些基因水平的研究结果与利用高特异性 NF-kB 抑制剂的 实验结果一致。S Makarov 等研究发现以脂质体为载体的 NF-kB 诱骗物(含有 NF-kB 结合位点的双链寡核苷酸)能够有效地防 止大鼠 SCW 关节炎复发。 而且发现不仅使用脂质体处理的关节炎得到改善, 对侧未处理的关节也得到了改善。 说明局部抗 NF-kB 治疗具有全身作用[90]。在一项类似运用 NF-kB 诱骗物的研究中大鼠的 CIA 关节炎也明显得到改善,而且关节内 IL-1 和 TNFα 的生成也被抑制[91]。Palombella 等人研究发现抑制 IkB 降解的蛋白酶抑制剂对大鼠的 SCW 关节炎具有改善作用[92]。以上动 物实验对使用 NF-kB 抑制剂治疗 RA 提供了强有力的支持。 五) .抗 NF-kB 治疗 RA 的展望 虽然在 RA 的动物模型中抗抗 NF-kB 治疗取得了可喜的成果,但是依然存在很多问题。首先,将来的临床治疗需要高效的,高 特异性的 NF-kB 途径抑制剂。第二,长期使用特异性的 NF-kB 途径抑制剂的安全性问题有待阐明。从基因水平的研究揭示基础 的 NF-kB 活性是正常发育所必需的,尤其对肝脏的凋亡具有保护作用,NF-kB 途径失活会产生有害的副作用[93]。针对细胞因 子诱导 NF-kB 激活途径的中的组成部分,而不影响基础的 NF-kB 活性是一种巧妙的解决办法。May 等人近来尝试了这种办法 [94],他们设计了一种源自 IKKγ/NEMO 的肽,能够阻断 IKK 信号体的装配。此肽能够强烈抑制细胞因子诱导的 NF-k 活化,而 12 不影响 NF-kB 的基本活性。体内使用细胞透过性抑制肽能够抑制腹膜炎及耳部水肿的动物模型的炎症。另一个值得重视的问题 是 NF-kB 全身抑制会损害机体对致病原的防御性应答功能。 但是可以通过使用针对某一组织或细胞型的靶向性抑制剂来减轻抗 NF-kB 治疗的副作用。从这点考虑基因导入的 NF-kB 抑制剂具有独特的优势[95]。局部治疗减轻全身治疗带来的副作用能够把 全身免疫抑制的风险减到 13

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